提供荧光免疫鉴定
用途：仅供科研使用
仪器：离心机、生物安全柜、电动移液器、O2 培养箱、倒置显微镜、液氨罐、恒温水浴锅、超低温冰箱
试剂：胎牛血清 (FBS)、无菌 1XPBS pH=7.2、0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA、完全培养基(含血清)、冻存液: 90%FBS+10%DMSO、异丙醇
耗材：离心管 (15ml、50ml)、T-25 细胞培养瓶、一次性无菌移液管(2ml、 5ml、10ml)、1.8mL 冻存管、程序降温盒
护目镜、厚毛线手套等
操作流程：
复苏
1) 将恒温水浴锅中的水预热到 37℃；
2) 准备一支 15ml 离心管，加入 5ml 含 10%FBS 的完全培养基，放入 37℃水浴锅中预热；
3) 戴上护目镜，厚毛线手套后，从液氮罐中取出要复苏的细胞，尽快转入 37℃恒温水浴锅中复温晃 动冻存管以提高复温速率；
4) 将融化了的冻存管中的细胞吸入事先准备的离心管中，混匀后，1000rpm 离心 5min；
5) 准备一个 T-25 培养瓶，写上细胞名称、日期，再加入 4ml 完全培养基；
6) 离心完成后弃去上清，用 1ml 完全培养基重悬细胞后，转入 T-25 细胞培养中，混匀后转入CO2 培养箱中培养静置
注意：从液氮中取出细胞冻存管时，若冻存管内有液氮进入，需拧松冻存管，排出内部残留的液氮，之后拧紧冻存管，置于干冰上，然后放入 37℃水浴中，避免温差太大造成液氮快速气化而爆炸。
传代
（细胞传代建议一传二）
1) 当细胞汇合度达到 85%以上时，可进行传代。
2) 在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，收集瓶内的培养基；
3) 向培养瓶内加入 3ml 无菌的 1×PBS 后，水平放置培养瓶，使 PBS 能够浸润到培养瓶底面上所有的面积，吸弃 PBS；
4) 向瓶内加入消化液 1ml，浸润底面后放入 37℃ CO2 培养箱中孵育 1~2min；
5) 孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，若全部消化下来则直接向培养瓶内加入
注：如还有部分细胞未消化下来，可采用分步消化：
2ml 含 10%FBS 的培养基（这里的培养基可以用DMEM或者其他的基础培养基，这里只是中和胰酶用，不是培养细胞用，另一方面还可以节约完全培养基的使用）中，将悬液吸入15ml离心管；
① 准备一个无菌的 15ml 离心管，加入 2ml 含 10%FBS 的培养基；
② 将消化下来的细胞吸入①中的离心管内中和（避免吹打）；
③ 向之前消化的培养瓶中加入 1ml 胰酶继续消化 5min 左右，轻拍培养瓶，95%左右细胞脱落后加入 2ml 含 10%FBS 的完全培养基中和，中和后的细胞悬液移入①中的离心管内。
6) 1000rpm 离心 5min；
7) 准备两个新的 T-25 培养瓶，各加入 4ml 完全培养基。
8) 离心完成后，弃上清，用 2ml 完全培养基重悬离心细胞，将重悬后的细胞转入 2 个 T-25 培养瓶，每个培养瓶各 1ml；
9) 水平放置培养瓶，震荡混匀后，将培养瓶置于 37℃，5%CO2 培养箱中静置培养。
冻存
（细胞冻存建议每瓶 T25 冻一支）
1）~6）参照传代步骤
7） 离心完成后，弃上清，用 1mL 冻存液重悬细胞沉淀，然后转入 1.8ml 冻存管中；
8） 将冻存管转入填充满异丙醇的程序降温盒中，之后转入-80℃冰箱中过夜降温；
9） 第二天，取出降温完成的序降温盒中的冻存管，尽快转入液氮罐中保存。
