提供荧光免疫鉴定
用途：仅供科研使用
仪器：离心机、生物安全柜、电动移液器、O2 培养箱、倒置显微镜、液氨罐、恒温水浴锅、超低温冰箱
试剂：胎牛血清 (FBS)、无菌 1XPBS pH=7.2、0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA、完全培养基(含血清)、冻存液: 90%FBS+10%DMSO、异丙醇
耗材：离心管 (15ml、50ml)、T-25 细胞培养瓶、一次性无菌移液管(2ml、 5ml、10ml)、1.8mL 冻存管、程序降温盒
护目镜、厚毛线手套等
二、操作流程：
复苏
1) 将恒温水浴锅中的水预热到 37℃；
2) 准备一支 15ml 离心管，加入 5ml 含 10%FBS 的完全培养基，放入 37℃水浴锅中预热；
3) 戴上护目镜，厚毛线手套后，从液氮罐中取出要复苏的细胞，尽快转入 37℃恒温水浴锅中复温晃
动冻存管以提高复温速率；
4) 将融化了的冻存管中的细胞吸入事先准备的离心管中，混匀后，1000rpm 离心 5min；
5) 准备一个 T-25 培养瓶，写上细胞名称、日期，再加入 4ml 完全培养基；
6) 离心完成后弃去上清，用 1ml 完全培养基重悬细胞后，转入 T-25 细胞培养中，混匀后转入
CO2 培养箱中培养静置
注意：从液氮中取出细胞冻存管时，若冻存管内有液氮进入，需拧松冻存管，排出内部残留的液
氮，之后拧紧冻存管，置于干冰上，然后放入 37℃水浴中，避免温差太大造成液氮快速气化而爆
炸。
传代
（细胞传代建议一传二）
1) 当细胞汇合度达到 85%以上时，可进行传代。
2) 在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，收集瓶内的培养基；
3) 向培养瓶内加入 3ml 无菌的 1×PBS 后，水平放置培养瓶，使 PBS 能够浸润到培养瓶底面上所有的
面积，吸弃 PBS；
4) 向瓶内加入消化液 1ml，浸润底面后放入 37℃ CO2 培养箱中孵育 1~2min；
5) 孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，若全部消化下来则直接向培养瓶内加入
注：如还有部分细胞未消化下来，可采用分步消化：
2ml 含 10%FBS 的培养基（这里的培养基可以用DMEM或者其他的基础培养基，这里只是中和
胰酶用，不是培养细胞用，另一方面还可以节约完全培养基的使用）中，将悬液吸入 15ml
离心管；
① 准备一个无菌的 15ml 离心管，加入 2ml 含 10%FBS 的培养基；
② 将消化下来的细胞吸入①中的离心管内中和（避免吹打）；
③ 向之前消化的培养瓶中加入 1ml 胰酶继续消化 5min 左右，轻拍培养瓶，95%左右细胞
脱落后加入 2ml 含 10%FBS 的完全培养基中和，中和后的细胞悬液移入①中的离心管内。
6) 1000rpm 离心 5min；
7) 准备两个新的 T-25 培养瓶，各加入 4ml 完全培养基。
8) 离心完成后，弃上清，用 2ml 完全培养基重悬离心细胞，将重悬后的细胞转入 2 个 T-25 培养瓶，
每个培养瓶各 1ml；
9) 水平放置培养瓶，震荡混匀后，将培养瓶置于 37℃，5%CO2 培养箱中静置培养。
冻存
（细胞冻存建议每瓶 T25 冻一支）
1）~6）参照传代步骤
7） 离心完成后，弃上清，用 1mL 冻存液重悬细胞沉淀，然后转入 1.8ml 冻存管中；
8） 将冻存管转入填充满异丙醇的程序降温盒中，之后转入-80℃冰箱中过夜降温；
9） 第二天，取出降温完成的序降温盒中的冻存管，尽快转入液氮罐中保存。
0%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。
4）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。 收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1：2传代 。
细胞处理：
冻存细胞的复苏：：
将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。
细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：
弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。
3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。
3）细胞冻存: 收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。下面T25瓶为例；
1. 细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.
2. 1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。
3. 将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。
注意事项：
1. 所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。
2. 建议在复苏冻存细胞时始终使用防护手套、衣服和戴上防护面罩。注意：冻存管浸没在液氮中会泄漏，并会慢慢充满液氮。解冻时，液氮转化成气相可能导致容器爆炸或用危险力吹掉其盖子，从而产生飞扬的碎屑造成人员伤害。
